Büyük olasılıkla Ludovico’nun aracılığıyla, Leonardo o güne kadarki en büyük siparişini aldı-Santa Maria delle Grazie Kilisesi’nin yemekhanesi için Son Akşam Yemeği’nin freski.Kilisenin baş hamisi Ludovico haftada iki ke bu yemekhanede akşam yemeği verdi.
Leonardo’nun tuttuğu notlardan, İsa’nın havarileriyle birlikte yediği son akşam yemeğinin nasıl resmedileceğine dair epey kafa yorduğunu biliyoruz. Bir masada oturan on üç adam muhtemelen çok sıkıcıydı. Floransa’da bulunan Sant’ Apollonia Manastırı’ndaki bir başka Son Akşam Yemeği’nde başka türlü durağan bir sahne halini alacak bu dokunaklı dramı canlandırmak için mermer panoların büyüleyici görüntüsüne başvurulmuştu.
Ama Leonardo’nun istediği, yaşanılan dramın bizzat figürler tarafından açığa vurulduğu bir sahneydi. Dikkatini İsa’nın, havarilerinden birinin kendisine ihanet edeceğini açıkladığı o anın psikolojik yoğunluğuna verdi. Leonardo defterlerinden birine tablo için kullanabileceği şöyle bir bir senaryoyu not etmişti.
“Bir başkası yanındakinin kulağına fısıldarken, Yahuda kulağını yanındakine yaklaştırır., bu arada bir elinde bıçağı tutarken ,diğer elinde başka bir bıçağa saplanmış yarım bir somon vardır.” Leonardo’nun, kendi Last Supper’ında kullandığı öğeleri yine saraydaki gündelik yaşamından aldığı aşikardı. Tuttuğu bir başka notsa, İsa’nın kimi andırması gerektiğine dairdi: “İsa için Kont Giovanni, Mortaro kardinali ile birlikte olan.”
Leonardo’dan önceki resimlerde Yahuda, hain olduğunu belli eden bir biçimde masanın karşısına yerleştirilmişti. Fakat Leonardo tablodaki bütün figürleri masanın arkasında konumlandırdı. Pencere, merkezde olan İsa’nın başını tıpkı bir hale gibi çevrelemiştir, vücudu havarilerinkinden biraz daha iridir. Odada hareket halinde olmayan tek kişi odur, yalnızca aşağı, masaya doğru bakar, ağzı hainin kim olduğunu duyurmak üzere aralıktır. Herkes şok içindedir. Sağda Matta, Taddeus ve Simun hainin kim olduğunu tartışır. Diğerleri, “Ben miyim?” diye sormak için dönerler. Birbirlerinden olduğu kadar kendi samimiyetlerinden de kuşku duyarlar. İsa’nın hemen sağındaki Yahuda elini İsa ve kendisi arasında duran tabağa uzatır ve biraz sonra İsa buyurur:”Benimle birlikte tabağa elini uzatan, bana ihanet edenle aynı kişidir.”